慢性粒细胞性白血病急性变时核基质的改变及其意义
作者：李 娟 罗绍凯 洪文德 张国材
单位：中山医科大学第一附属医院血液科(广州 510080)
关键词：核基质；蛋白；白血病，慢性
肿瘤990113 核基质(Nuclear Matrix)是存在于真核细胞内除了核膜、Lamina、染色体与核仁以外的非水溶性蛋白为主的网架结构体系，近年来的研究表明：核基质体系不仅在维持细胞与核的形态、细胞分裂与分化等方面具重要作用，而且直接参与了细胞的基因调控等基本生命活动，与肿瘤的发生及发展有直接相关[1]。癌细胞核基质蛋白成分与正常细胞相比有明显改变[2]。因此，本文分别比较了2例慢性粒细胞性白血病患者在疾病慢性期和急变期白血病细胞核基质蛋白成分的改变，通过动态观察核基质蛋白在慢性粒细胞性白血病的疾病转变中的改变，探讨核基质蛋白在慢粒急变中的可能作用和意义。
, 百拇医药
材料和方法
1.标本来源及细胞准备 标本来源：A、B 2例来源于本院血液内科追踪观察的慢性粒细胞性白血病患者，两个病例诊断均符合1990年全国血液病诊断标准[3]，经Ph染色体、bcr/abl基因检测均呈阳性的反应，A、B 2例由确诊慢性粒细胞性白血病慢性期至发生急粒变的时间分别为8个月及15个月，2例治疗均间断服用过羟基脲0.5 g～3 g/天，确诊慢性粒细胞性白血病急性变时均为停药1个月以后。细胞准备：分别在A、B 2例患者确诊慢性粒细胞白血病慢性期及急变期时抽取骨髓20 ml，用Ficoll液分离出单个核细胞，用PBS洗3次，调整细胞总数为2×109。
2.对照标本 正常对照E标本来自本院胸外科因结核瘤切除术切除的肋骨，用咬骨钳咬出骨髓细胞，另一正常标本F来自异体骨髓移植供体的骨髓，细胞准备工作及细胞总数调整同上。
3.核基质蛋白(NMP)的提取 参照Fey[4]等的方法，主要是细胞骨架(CSK)缓冲液(10 mmol PIPES pH6.8, 100 mmol KCl, 3 mmol MgCl2, 1 mmol EGTA, 300 mmol sucrose, 0.5% Triton X100和PMSF)处理15 min，细胞质膜体系被溶解、胞浆内可溶性蛋白流失；用含DNA酶、RNA酶的消化液处理后去掉染色质，沉淀物即为核骨架蛋白和中间纤维成分，通过透析液(含0.15 mol KCl, 25 mmol imidazole HCl, 5 mmol MgCl2,2 mmol DTT, 0.125 mmol EDTA, 0.2 mmol PMSF, pH 7.1)透析，使中间纤维成分析出，超高速离心取上清即为NMP，通过BSA试剂盒(光波长750 μm)测出NMP含量，用纯酒精使NMP重新析出，离心得到NMP，最后溶于尿素缓冲液中，-20℃分装保存。
, 百拇医药
4.SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳 NMP样品经SDS-PAGE电泳，SDS-PAGE参照Weber[5]等的方法，分离胶浓度为12%，浓缩胶为4%。
5.统计学处理 配对计量资料比较，及两个样本均数的比较，用t检验。
结 果
1.NMP含量的改变 每次抽提NMP前，细胞总数调整为2×109，慢性粒细胞性白血病于不同时期NMP含量改变见附表。
附表 慢性粒细胞性白血病患者慢性期及急变期NMP含量的变化(μg/2×109细胞) 病例
慢性期
急变期
, http://www.100md.com
P
A
420
557
<0.001
B
380
602
<0.001
P值分别为A、B 2例患者急变期与慢性期NMP含量的比较
正常对照的E、F两个标本NMP含量分别为310 μg/2×109细胞、280 μg/2×109细胞，2例慢性白血病患者不同时期白血病细胞标本NMP含量分别为489.75±106.51(
±s)，与正常对照组的285.00±21.21(±s)比较，P<0.01。
, http://www.100md.com
2.SDS-PAGE电泳结果及NMP成分的比较 各个标本NMP的SDS-PAGE电泳结果见附图。
(1)正常对照与慢性粒细胞性白血病慢性期NMP比较 由图可见，正常对照的E、F标本NMP条带种类较少，而白血病各NMP种类增多，且较复杂。A患者在慢性期时在66、40、23kD蛋白带上出现与正常相应细胞相比所没有的区带，B患者慢性期与正常相应细胞相比，较突出的变化是在35～40 kD之间出现多个区带。
附图 慢性粒细胞性白血病细胞、正常人骨髓细胞NMP SDS-PAGE电泳图
A：A患者慢性粒细胞性白血病慢性期；a：A患者慢性粒细胞性白血病急变期
B：B患者慢性粒细胞性白血病慢性期；b：B患者慢性粒细胞性白血病急变期
, 百拇医药
E、F：正常骨髓细胞对照； M：标准分子量(kD)
(2)慢性粒细胞性白血病慢性期与急粒变期NMP成分的比较：
A例慢性粒细胞性白血病患者在慢性期与急变期NMP的比较：两期的蛋白带具有一定的相似性，但某些条带上存在的量的差别，如在66 kD区带上急变期比慢性期增多，并出现了一些在急变期才有的蛋白带，比较明显的是在约18、20、25、28 kD区带上。B例慢性粒细胞性白血病患者慢性期与急变期NMP的比较与A病例相似，在约66 kD、50 kD、23 kD上，有量的增多，在18、20、21.5 kD上出现在急变期才有的蛋白带。
讨 论
早在70年代中期，Coffey和Berzney[6]提出了核基质的概念，近几年对核基质的功能有了较多认识：核基质与DNA复制、基因表达过程、RNA的修饰很密切，并参与染色质的包装和构建，核基质与细胞的分化、癌细胞发生有紧密联系，DNA不再是致癌因素作用的唯一位点。癌细胞与正常相应细胞的核基质蛋白成分有明显变化，由本实验可以看出：正常骨髓细胞与慢性粒细胞性白血病(慢性期、急变期)的核基质蛋白成分有很大区别，首先表现在NMP含量上，在相同的2×109细胞基础上提取的NMP，正常骨髓细胞明显低于白血病细胞的NMP含量。而且在SDS-PAGE电泳图上也可看出：正常骨髓细胞NMP成分较少，而且区带分布较均一。正常骨髓细胞与慢性粒细胞性白血病慢性期相比，后者出现了正常骨髓细胞所没有的一些条带，如A例患者的66、40、23 kD蛋白带，B例患者的35 kD～40 kD之间多个的区带，这些区带的蛋白质可能与白血病的发生、发展有关，但至于每一条带的功能还需进一步探讨。
, http://www.100md.com
NMP除了随不同细胞类型有差异外，在同一来源细胞的不同分化阶段也有改变[7、8]。慢性粒细胞性白血病从慢性期向急粒变时，细胞分化更不成熟，NMP含量在急变期明显增加，在SDS-PAGE电泳带上也可见在急性期某些区带的NMP含量增加，如A例患者在66 kD、B例在66、50、23 kD区带上有量的增加。更有意义的是急粒变后的A例患者在18、20、25、28 kD，B例患者在18、20、21.5 kD出现了新的区带，两者共同出现18、20 kD的区带，这可能与慢性粒细胞性白血病细胞急性变有密切相关，值得进一步的研究。本文的结果提示了核基质蛋白在慢粒急变中有质及量的改变，特别是新区带出现的蛋白，对我们进一步了解慢粒急变开拓了一条途径。从本实验结果还可看出，NMP含量随细胞分化不同而不同，分化差的细胞NMP含量增多，亦有待深入研究。
第一作者简介 李 娟，女，医学硕士，讲师。
参 考 文 献
, http://www.100md.com
1 Puck TT, Krystosek A: Role of the cytoskeleton in gene regulation and cancer. Int Rev Cytol. 1992, 132:75
2 Getzenbery RH. Nuclear matrix and regulation of gene expression tissue specificity. J Cell Biochem. 1994, 55:22
3 张之南主编，血液病诊断及疗效标准，天津科学技术出版社，1990
4 Fey EG, Wan KM, Penman S. Epithelial cytoskeletal framework and nuclear matrix-intermediate filament scaffold: three-dimensional organization and protein composition. J Cell Biol. 1984, 98:1973
, http://www.100md.com
5 Weber K, Osbom M. The reliability of molecular weight determination by clodeyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. J Biol Chem, 1969, 244:4406
6 Berezney R, Coffey DS. Identification of a nuclear protein matrix. Biochem Biophys Res Commun. 1974, 60:1417
7 Fey EG,Penman S: Nuclear matrix proteins reflect cell type of origin in cultured human cells. Proc Natl Acad Sci USA. 1988, 85:121
8 Berezney R. The nuclear matrix: a heuristic model for investigating genomic organization and function in the cell nucleus. J Cell Biochem. 1991, 47:109
(收稿：1997-09-22), 百拇医药
单位：中山医科大学第一附属医院血液科(广州 510080)
关键词：核基质；蛋白；白血病，慢性
肿瘤990113 核基质(Nuclear Matrix)是存在于真核细胞内除了核膜、Lamina、染色体与核仁以外的非水溶性蛋白为主的网架结构体系，近年来的研究表明：核基质体系不仅在维持细胞与核的形态、细胞分裂与分化等方面具重要作用，而且直接参与了细胞的基因调控等基本生命活动，与肿瘤的发生及发展有直接相关[1]。癌细胞核基质蛋白成分与正常细胞相比有明显改变[2]。因此，本文分别比较了2例慢性粒细胞性白血病患者在疾病慢性期和急变期白血病细胞核基质蛋白成分的改变，通过动态观察核基质蛋白在慢性粒细胞性白血病的疾病转变中的改变，探讨核基质蛋白在慢粒急变中的可能作用和意义。
, 百拇医药
材料和方法
1.标本来源及细胞准备 标本来源：A、B 2例来源于本院血液内科追踪观察的慢性粒细胞性白血病患者，两个病例诊断均符合1990年全国血液病诊断标准[3]，经Ph染色体、bcr/abl基因检测均呈阳性的反应，A、B 2例由确诊慢性粒细胞性白血病慢性期至发生急粒变的时间分别为8个月及15个月，2例治疗均间断服用过羟基脲0.5 g～3 g/天，确诊慢性粒细胞性白血病急性变时均为停药1个月以后。细胞准备：分别在A、B 2例患者确诊慢性粒细胞白血病慢性期及急变期时抽取骨髓20 ml，用Ficoll液分离出单个核细胞，用PBS洗3次，调整细胞总数为2×109。
2.对照标本 正常对照E标本来自本院胸外科因结核瘤切除术切除的肋骨，用咬骨钳咬出骨髓细胞，另一正常标本F来自异体骨髓移植供体的骨髓，细胞准备工作及细胞总数调整同上。
3.核基质蛋白(NMP)的提取 参照Fey[4]等的方法，主要是细胞骨架(CSK)缓冲液(10 mmol PIPES pH6.8, 100 mmol KCl, 3 mmol MgCl2, 1 mmol EGTA, 300 mmol sucrose, 0.5% Triton X100和PMSF)处理15 min，细胞质膜体系被溶解、胞浆内可溶性蛋白流失；用含DNA酶、RNA酶的消化液处理后去掉染色质，沉淀物即为核骨架蛋白和中间纤维成分，通过透析液(含0.15 mol KCl, 25 mmol imidazole HCl, 5 mmol MgCl2,2 mmol DTT, 0.125 mmol EDTA, 0.2 mmol PMSF, pH 7.1)透析，使中间纤维成分析出，超高速离心取上清即为NMP，通过BSA试剂盒(光波长750 μm)测出NMP含量，用纯酒精使NMP重新析出，离心得到NMP，最后溶于尿素缓冲液中，-20℃分装保存。
, 百拇医药
4.SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳 NMP样品经SDS-PAGE电泳，SDS-PAGE参照Weber[5]等的方法，分离胶浓度为12%，浓缩胶为4%。
5.统计学处理 配对计量资料比较，及两个样本均数的比较，用t检验。
结 果
1.NMP含量的改变 每次抽提NMP前，细胞总数调整为2×109，慢性粒细胞性白血病于不同时期NMP含量改变见附表。
附表 慢性粒细胞性白血病患者慢性期及急变期NMP含量的变化(μg/2×109细胞) 病例
慢性期
急变期
, http://www.100md.com
P
A
420
557
<0.001
B
380
602
<0.001
P值分别为A、B 2例患者急变期与慢性期NMP含量的比较
正常对照的E、F两个标本NMP含量分别为310 μg/2×109细胞、280 μg/2×109细胞，2例慢性白血病患者不同时期白血病细胞标本NMP含量分别为489.75±106.51(
±s)，与正常对照组的285.00±21.21(±s)比较，P<0.01。, http://www.100md.com
2.SDS-PAGE电泳结果及NMP成分的比较 各个标本NMP的SDS-PAGE电泳结果见附图。
(1)正常对照与慢性粒细胞性白血病慢性期NMP比较 由图可见，正常对照的E、F标本NMP条带种类较少，而白血病各NMP种类增多，且较复杂。A患者在慢性期时在66、40、23kD蛋白带上出现与正常相应细胞相比所没有的区带，B患者慢性期与正常相应细胞相比，较突出的变化是在35～40 kD之间出现多个区带。
附图 慢性粒细胞性白血病细胞、正常人骨髓细胞NMP SDS-PAGE电泳图
A：A患者慢性粒细胞性白血病慢性期；a：A患者慢性粒细胞性白血病急变期
B：B患者慢性粒细胞性白血病慢性期；b：B患者慢性粒细胞性白血病急变期
, 百拇医药
E、F：正常骨髓细胞对照； M：标准分子量(kD)
(2)慢性粒细胞性白血病慢性期与急粒变期NMP成分的比较：
A例慢性粒细胞性白血病患者在慢性期与急变期NMP的比较：两期的蛋白带具有一定的相似性，但某些条带上存在的量的差别，如在66 kD区带上急变期比慢性期增多，并出现了一些在急变期才有的蛋白带，比较明显的是在约18、20、25、28 kD区带上。B例慢性粒细胞性白血病患者慢性期与急变期NMP的比较与A病例相似，在约66 kD、50 kD、23 kD上，有量的增多，在18、20、21.5 kD上出现在急变期才有的蛋白带。
讨 论
早在70年代中期，Coffey和Berzney[6]提出了核基质的概念，近几年对核基质的功能有了较多认识：核基质与DNA复制、基因表达过程、RNA的修饰很密切，并参与染色质的包装和构建，核基质与细胞的分化、癌细胞发生有紧密联系，DNA不再是致癌因素作用的唯一位点。癌细胞与正常相应细胞的核基质蛋白成分有明显变化，由本实验可以看出：正常骨髓细胞与慢性粒细胞性白血病(慢性期、急变期)的核基质蛋白成分有很大区别，首先表现在NMP含量上，在相同的2×109细胞基础上提取的NMP，正常骨髓细胞明显低于白血病细胞的NMP含量。而且在SDS-PAGE电泳图上也可看出：正常骨髓细胞NMP成分较少，而且区带分布较均一。正常骨髓细胞与慢性粒细胞性白血病慢性期相比，后者出现了正常骨髓细胞所没有的一些条带，如A例患者的66、40、23 kD蛋白带，B例患者的35 kD～40 kD之间多个的区带，这些区带的蛋白质可能与白血病的发生、发展有关，但至于每一条带的功能还需进一步探讨。
, http://www.100md.com
NMP除了随不同细胞类型有差异外，在同一来源细胞的不同分化阶段也有改变[7、8]。慢性粒细胞性白血病从慢性期向急粒变时，细胞分化更不成熟，NMP含量在急变期明显增加，在SDS-PAGE电泳带上也可见在急性期某些区带的NMP含量增加，如A例患者在66 kD、B例在66、50、23 kD区带上有量的增加。更有意义的是急粒变后的A例患者在18、20、25、28 kD，B例患者在18、20、21.5 kD出现了新的区带，两者共同出现18、20 kD的区带，这可能与慢性粒细胞性白血病细胞急性变有密切相关，值得进一步的研究。本文的结果提示了核基质蛋白在慢粒急变中有质及量的改变，特别是新区带出现的蛋白，对我们进一步了解慢粒急变开拓了一条途径。从本实验结果还可看出，NMP含量随细胞分化不同而不同，分化差的细胞NMP含量增多，亦有待深入研究。
第一作者简介 李 娟，女，医学硕士，讲师。
参 考 文 献
, http://www.100md.com
1 Puck TT, Krystosek A: Role of the cytoskeleton in gene regulation and cancer. Int Rev Cytol. 1992, 132:75
2 Getzenbery RH. Nuclear matrix and regulation of gene expression tissue specificity. J Cell Biochem. 1994, 55:22
3 张之南主编，血液病诊断及疗效标准，天津科学技术出版社，1990
4 Fey EG, Wan KM, Penman S. Epithelial cytoskeletal framework and nuclear matrix-intermediate filament scaffold: three-dimensional organization and protein composition. J Cell Biol. 1984, 98:1973
, http://www.100md.com
5 Weber K, Osbom M. The reliability of molecular weight determination by clodeyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. J Biol Chem, 1969, 244:4406
6 Berezney R, Coffey DS. Identification of a nuclear protein matrix. Biochem Biophys Res Commun. 1974, 60:1417
7 Fey EG,Penman S: Nuclear matrix proteins reflect cell type of origin in cultured human cells. Proc Natl Acad Sci USA. 1988, 85:121
8 Berezney R. The nuclear matrix: a heuristic model for investigating genomic organization and function in the cell nucleus. J Cell Biochem. 1991, 47:109
(收稿：1997-09-22), 百拇医药